將超氧化物歧化酶（SOD）、辣根過氧化物酶（HRP）和淀粉酶（α- AMY）置于真空環境中不同時間，測試真空對超氧化物歧化酶、辣根過氧化物酶和α－淀粉酶活性的影響。不同真空處理時間對酶蛋白活性有不同影響，在處理時間為3～15 min 范圍，超氧化物歧化酶、辣根過氧化物酶和α－淀粉酶相對活性基本上都呈降低的趨勢。因此，在離子注入生物效應的研究中，應該考慮真空對生物體所產生的影響。

　　低能離子注入生物技術已被成功地應用于農作物改良、細胞刻蝕和轉基因工程等方面。目前，對其機理的研究多集中在細胞和個體水平上，對分子水平上的輻照損傷如DNA 鏈的斷裂、核甘酸和堿基損傷的研究也取得了一定的進展。但由于離子注入過程是在真空條件下進行的，那么，真空本身對生物體特別是生物大分子是否存在影響， 是值得研究的一個問題。本文以SOD(超氧化物歧化酶)、HRP(辣根過氧化物酶)和α- AMY(α－淀粉酶)為研究對象，將酶蛋白置于離子注入時的真空條件下不同時間， 研究了不同真空時間對其活性的影響。研究結果對離子注入生物體效應的機理分析與應用研究具有重要的意義。

1、材料與方法

1.1、材料

　　辣根過氧化物酶結晶粉末(購自于北京拜爾迪生物技術公司，標定酶活力為250 u/mg)；超氧化物歧化酶(購自于華東理工大學生物工程學院，標定酶活力為1000 u/mg)；α- 淀粉酶(購自于Sigma 公司，標定酶活力為1.8 u/mg)。

1.2、實驗設備

　　紫外- 可見分光光度計（TU- 1800PC 型，北京譜析通用公司）、精密酸度計（PHS- 2C 型，上�？祪x儀器有限公司）、電子天平（BP310S 型，北京塞多利斯儀器系統有限公司）。

1.3、實驗方法

1.3.1、樣品的處理

　　取一定質量的測試樣品放置于培養皿中，樣品面積約6 cm2，厚度大約1.0 mm。將樣品置于離子注入機（中國科學院等離子研究所）靶室中對樣品進行處理，待真空度達到10^{- 3} Pa 時（離子注入真空條件），開始計時，真空處理樣品時間分別取t＝3 min，6 min，9 min，12 min，15 min。

1.3.2、活性的測定

　　SOD 活性的測定按季鍵平的方法進行；HRP 活性測定按張龍翔的方法進行；α－淀粉酶按李合生方法進行。酶蛋白的相對活性定義為：

　　其中At 為處理組樣品活性，A0 為對照組樣品活性。

2、實驗結果

2.1、真空對超氧化物歧化酶活性的影響

　　圖1 給出不同真空處理時間對超氧化物歧化酶相對活性的影響�？梢钥闯觯�不同處理時間入對超氧化物歧化酶相對活性的影響程度不同。與對照相比，真空處理時間為6 和9 min 時，酶相對活性分別增加了為49.7%和39.3%；真空處理時間為3、12 和15 min 時，酶相對活性分別降低了35.8%、73.1%和48.4%。

圖1 不同真空時間對SOD 相對活性的影響

2.2、真空對辣根過氧化物酶活性的影響

　　圖2 給出了不同真空處理時間對辣根過氧化物酶相對活性的影響。結果表明，不同處理時間對辣根過氧化物酶相對活性的影響程度不同。與對照相比，辣根過氧化物酶經真空處理后其相對活性均降低，降低幅度在1.0%～40.2%，其中處理時間為6 min 時，降幅最小，處理時間為9 min 時，降幅最大，但在處理時間為3 min時，相對酶活性增加26.2%。

圖2 不同真空時間對HRP 相對活性的影響　圖3 不同真空時間對α－AMY 相對活性的影響

2.3、真空對α－淀粉酶活性的影響

　　圖3 給出了不同真空處理時間對α－淀粉酶相對活性的影響�？梢钥闯觯�不同處理時間入對α－淀粉酶相對活性的影響程度不同。與對照相比，α－淀粉酶經真空處理后其相對活性均降低，降低幅度在2.4%～25.7%，其中處理時間為12 min 時，降幅最小，處理時間為15 min 時，降幅最大。

3、討論

　　已有研究表明：離子注入干種子過程中一般含水量損失大約50%；當細胞或愈傷組織突然暴露于真空靶室時，由于表面水分的蒸發帶走了大量的汽化熱，細胞或愈傷組織自身溫度迅速的下降，當達到相平衡時，兩相界面的溫度應降至0℃以下。可知此時的細胞或愈傷組織表面的水分早已形成冰殼。如果維持真空度不變（蒸汽壓不變），則冰殼表面的溫度不變。在熱傳導的作用下，整個愈傷組織和細胞的水分將結冰。在進行離子注入活體生物實驗時，生物活體不僅散失大量的水分，而且還受到冷凍的影響。

　　真空處理過程必然伴隨脫水的過程。水分子的存在可以增加氫鍵形成的幾率，當兩個球蛋白分子在水溶液中互相靠近時，由于水分子的作用，蛋白分子相應肽段之間形成一定形式的β 折疊，這種β 折疊比正常的分子內β 折疊的能量高，穩定性較低。從能量角度講α- 螺旋比β-折疊穩定，而無規卷曲結構是最不穩定的。因此從這個意義上考慮, 超氧化物歧化酶、辣根過氧化物酶和α－淀粉酶在真空過程中可能由于有序結構含量的減少，無序結構含量的增加導致了其相對活性的下降。

　　我們的研究結果表明，在離子注入生物效應的研究中，應該考慮真空對生物體所產生的影響，不能完全歸之于注入離子的生物效應。